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沪鼎产品文献:可溶性B7-H3在人脑创伤合并骨折愈合中的表达及意义

发布日期:2019/8/30 10:03:54 阅读次数:265次

可溶性B7-H3在人脑创伤合并骨折愈合中的表达及意义
高舒妤,朱国宴,郭国宁
[摘 要] 目的 检测外周血中可溶性B7-H3在脑创伤合并骨折,单纯骨折和单纯脑损伤患者中的表达,并研究其对间充质干细胞分化为成骨细胞的作用。方法 ELISA检测可溶性B7-H3及骨折愈合的标志物Cbfa1在脑创伤合并骨折、单纯骨折,单纯脑创伤和正常志愿者外周血中的表达,茜素红、real-time PCR检测不同浓度重组B7-H3蛋白对间充质干细胞向成骨细胞分化的作用。结果 可溶性B7-H3在脑创伤合并骨折及单纯脑创伤患者中的表达明显高于单纯骨折和正常人中的表达;可溶性B7-H3在外周血中的含量与脑创伤严重程度相关;重组B7-H3蛋白可促进间充质干细胞向成骨细胞的分化,并随着质量浓度的升高其促分化能力增强。结论 脑创伤导致的外周血中升高的可溶性B7-H3促进了骨折愈合。
[关键词] B7-H3;脑创伤合并骨折;骨折愈合;间充质干细胞
[中图分类号] R392.7
[文献标识码] A

骨折愈合是一个受到全身或局部多因素调控的、包括成骨细胞和破骨细胞参与的动态平衡过程,其愈合速度受多种因素的影响。临床发现颅脑损伤后出现骨痂过度生长,异位骨化率增加,骨折愈合加快的现象。虽有不少文献从不同角度探讨颅脑创伤促骨折愈合的机制,但对脑创伤后为何促进骨折愈合仍知之甚少。B7-H3(CD276)是 B7 家族的新成员,具膜结合型和可溶性2种存在方式。作为共刺激或共抑制分子,能介导T细胞的免疫调控反应,并与肿瘤的发生发展相关。对于其非免疫功能,B7-H3敲除鼠易发生骨折,而且 B7-H3 缺失的颅骨细胞成骨分化受阻,表明 B7-H3 参与了成骨细胞的分化过程,采用特异性抗体4H7刺激人间充质干细胞膜上的B7-H3,可直接促进其分化为成骨细胞。
可溶性B7-H3(soluble B7-H3,sB7-H3)是膜结合型的可溶形式,可由单核细胞,树突状细胞,激活的T细胞以及mB7-H3+的细胞释放,研究发现在脓毒症患者或儿童肺炎患者中,血清中的sB7-H3均表达升高,并与炎性因子的释放呈正相关。sB7-H3与骨折愈合的研究未见报道。间充质干细胞属于成体干细胞,在不同诱导条件下,具有向成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞等多种细胞分化的潜能,并且由于具来源广泛、细胞增殖快、异体移植排斥反应轻等优点,在骨组织工程中备受重视,是形成成骨细胞的主要来源。
为研究sB7-H3在脑创伤合并骨折愈合中的作用,我们对临床脑创伤合并骨折与单纯骨折患者及单纯脑创伤患者sB7-H3表达与骨折愈合的关系进行了探讨,研究了体外加入重组B7-H3蛋白对间充质干细胞分化为成骨细胞的作用。
1 资料与方法
1。1 临床资料 选取自 2014 年 2 月至 2016 年 11 月入住重庆西南医院急救部的患者共56例(男36例,女20例),分别纳入单独脑创伤组(TBI)13例,单独骨折组(Fracture)20 例,脑创伤合并骨折组(TBI+fracture)23例,骨折部位包括:股骨(femur)骨折14例,胫腓骨(tibia and fibula)骨折 11 例,肱骨(humerus)骨折 10 例,尺挠骨(ulna and radius)骨折 8 例,另选择健康体检志愿者10例为对照组。入院时有脑创伤的患者按GCS评分分级:GCS>12 为轻度(Mild)脑创伤(6 例),9≤GCS≤12 为中度(Moderate)(9 例),3≤GCS≤8 为重度(Severe)(8例),所有病例均排除伤前神经病理或与骨相关的疾病,类风湿性关节炎、糖尿病及采用类固醇或双膦酸治疗的疾病。本研究经陆军军医大学(第三军医大学)*附属医院伦理委员会批准并获得患者知情同意书。
1.2 血清样本的收集 所有患者均于入院后12 h内采血,正常志愿者清晨空腹采集外周静脉血 3 ml,4 ℃冰箱放置过夜,3 500 g离心10 min,吸出上层血清置于-80 ℃冰箱保存备用。
1.3 ELISA 检 测 人 B7-H3 ELISA 试 剂 盒 购 自Ebioscience公司,人Cbfa1 购自上海沪鼎生物科技有限公司。实验操作按说明书进行。
1.4 间充质干细胞培养及诱导分化 培养人间充质干细胞至第3代,更换间充质干细胞培养基为成骨细胞诱导培养基(赛业生物),并分别加入2 μg/ml和5 μg/ml 的重组 B7-H3 蛋白(R&D 公司),培养 14 d后,茜素红S染色检测成骨细胞矿化,在显微镜下任意选择 5 个视野,进行细胞数统计;收获细胞,real-time PCR检测Cbfa1的表达。
1.5 RNA提取和real-time PCR检测 Trizol法提取RNA,测定浓度及纯度。人源 Cbfa1 基因的定量表达 检 测 基 于 L40992 序 列 进 行 引 物 设 计(PrimerPrimie 5.0软件辅助),随后BLAST确认引物特异性,预期产物长度132 bp,用GAPDH作内参,预期产物长度 197 bp,交由上海生工生物工程有限公司合成。取1 μg总RNA,按照TOYOBO逆转录试剂盒说明书进行逆转录,进行 SYBR 掺入法半定量检测Cbfa1的相对表达量(2-△△CT法),反应条件: 95 ℃预变性 30 s,95 ℃变性 5 s,60 ℃退火 30 s,40 个循环,完成PCR扩增。引物序列如下:Cbfa1 F:5′-CCGCCTCAGTGATTTAGGGC-3′,R:5′-GGGTCTGTAATCTGACTCTGTCC-3′;GAPDH F:5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′,R:5′-GCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。
1.6 统计学分析 数据用均数±标准差表示,采用SPSS11.0软件进行统计分析。对定量资料,2个样本之间的比较采用t检验,多个样本之间的比较行单因素方差分析;对分类资料,用卡方分析检验其构成比,若有理论频数小于 5,则进行 Fisher 精确检验。P<0.05认为差异有统计学意义。
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