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ELISA实验中小问题中藏着大智慧

发布日期:2019/10/23 16:56:38 阅读次数:25次

    ELISA试验中会遇到不少问题,不是这有点小问题,就是那有点小问题,那怎么办呢?来,跟着沪鼎小编,小编都帮您整理出来了!

    Q1.标曲不显色或显色很弱,样本显色

    溶解标准品以及倍比稀释时,未涡旋震荡或不够充分。
    
    标准品溶解、倍比稀释时均需要涡旋震荡以保证充分混匀。单纯依靠移液器反复吹打,效率较低、效果也不一定*佳。

    Q2.标曲和样本均不显色

    在孵育阶段静置在桌面上,这样非常不利于抗原抗体之间的充分接触,导致显色偏弱。

    推荐孵育阶段,使用ELISA专用的微孔板振荡器,调至合适的频率,使抗原抗体充分接触,保证结合效果。如果排除上述原因,有可能是漏加了某个组分,如检测抗体、酶等。对于比较马虎的新手,一定要做好标记和记录,或者使用添加染料的。

    Q3.标曲显色,样本不显色

    当样本中目的蛋白浓度极低或者样本中干扰因素较强,就无法检测到。目前ELISA仍然是蛋白检测灵敏度*的方法,与不同技术结合后,衍生出了多种类型的ELISA,提高了检测灵敏度。

    对于目的蛋白浓度特别低的样本,可以尝试用高敏ELISA,但这也并不意味着一定能检测到样本浓度,只能说可以提高样本的可测率,并使结果更加可靠。因为通常用普通ELISA检测的样本OD值都偏低,而高敏ELISA可提高样本OD值,使之尽量位于标曲范围内,得到的数值也更加可信。

    Q4。标曲和样本都显色,但复孔的CV大

    这个问题就跟移液器和实验者的操作有关了。移液器的使用维护不规范,就会造成移液的误差较大;实验者自身的操作习惯、加样的一致性对复孔的CV也有很大影响。

    掌握移液器的正确使用和维护。关于个人的操作可练习移液动作、加快速度,确保移液的精密度。

    Q5。本底偏高,样本值测不到

    标曲的本底即Blank孔的OD值一般要求控制在0。1以下(对于高敏ELISA可以适当放宽要求)。尤其是样本值特别低的时候,本底过高会掩盖目的信号,导致无法测到样本值。
在加入TMB显色后,需实时观察标曲显色情况。通常在S5孔有肉眼可见的微弱蓝色,即可终止反应。

    Q6.样本经不同梯度稀释,计算得到的样本值差异较大

    有时候我们不清楚样本中目的蛋白的浓度如何,应该如何稀释,那么我们就会做下预实验,确定稀释倍数。然而有时候同一样本做了几个不同梯度稀释后,计算得到的样本值之间差异较大,应该选择哪一个稀释倍数呢?

    这里涉及到了基质效应。通常血清样本加样量较高时,血清中的各种蛋白会抑制抗原抗体的接触,基质效应较明显。而经过稀释后,干扰因素也随之稀释,影响就会较小。当某两个梯度稀释后,计算得到的样本值接近时,我们就可以认为在该稀释梯度时,样本中的干扰因素影响较小,计算得到的值也是接近真实的。然而这样的稀释是针对目的蛋白浓度较高的样本而言。对于浓度很低的样本,经过多倍稀释后,就更加测不到了,此时可按照厂家说明书推荐的加样方式操作。

    Q7.不同试剂盒中的组分能否通用

    除非是公用的试剂如洗液、检测缓冲液,其它组分不建议用其它试剂盒的组分,甚至是同一指标不同批次的试剂盒里的组分。这些组分(包括标准品、标准品稀释液、检测抗体、酶等)都是经过优化的,如果贸然使用其它试剂盒的组分,有可能对结果产生影响。

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