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浅析ELISA中的常见问题

发布日期:2019/12/4 10:33:16 阅读次数:407次

    ELISA是蛋白定量的金标准,也是免疫学研究中*常用的实验方法。很多人觉得ELISA很简单,其实不然。ELISA中出现的各种问题,正是很多人对其认识不足而产生的。今天跟大家分析一下ELISA实验中的常见问题,希望对大家有所帮助。

    一、标曲不显色或显色很弱,样本显色

    溶解标准品以及倍比稀释时,未涡旋震荡或不够充分。标准品溶解时,需要涡旋震荡,以保证充分溶解。在做倍比稀释时,也要涡旋震荡以保证充分混匀。单纯依靠移液器反复吹打,效率较低、效果也不一定*佳。

    二、标曲和样本均不显色

    在孵育阶段静置在桌面上,这样非常不利于抗原抗体之间的充分接触,导致显色偏弱。推荐孵育阶段,使用ELISA专用的微孔板振荡器,调至合适的频率,使抗原抗体充分接触,保证结合效果。

    如果排除上述原因,有可能是漏加了某个组分,如检测抗体、酶等。对于比较马虎的新手,一定要做好标记和记录,或者使用添加染料的elisa试剂盒

    三、标曲显色,样本不显色

    遇到这种情况,很多人觉得是试剂盒问题,这其实是一个误区。任何一种实验方法,都有其局限性,当样本中目的蛋白浓度极低或者样本中干扰因素较强,就无法检测到。目前ELISA仍然是蛋白检测灵敏度*的方法,与不同技术结合后,衍生出了多种类型的ELISA,提高了检测灵敏度。如采用信号增强剂的高敏ELISA、ECL为底物的化学发光ELISA、采用荧光法检测的ELISA、结合PCR扩增的免疫PCR等等。

    对于目的蛋白浓度特别低的样本,可以尝试用高敏ELISA,但这也并不意味着一定能检测到样本浓度,只能说可以提高样本的可测率,并使结果更加可靠。因为通常用普通ELISA检测的样本OD值都偏低,甚至低于标准品浓度*的S7点,虽然可以计算得到数值,但实际上这个数值的可信度已经降低了。而高敏ELISA可提高样本OD值,使之尽量位于标曲范围内,得到的数值也更加可信。需要指出的是,国内某些所谓的高敏,并没有采用信号增强剂的方法,而只是简单地提高了抗体浓度,较普通ELISA其灵敏度的提升有限。

    还有人觉得,为什么用其它厂家的试剂盒可以测到样本值,而我们的就是测不到呢?这里就涉及到回收率这个概念了,详细的阐述下次有机会可以跟大家再聊一聊。简单来说,回收率就是样本的真实值和理论值之间的比值,优秀试剂盒的这个数值在80 – 120%之间。与回收率相关的试剂就是试剂盒中的标准品稀释液。筛选出合适的标准品稀释液,使目的蛋白含量接近的标准品和样本显色速度相似,那么计算得到的样本值也会比较接近真实值。要想测到样本值并不是很难,只要选择合适的标准品稀释液,压低标曲的本底,自然就会计算得到样本值,然而这样的样本值并不真实,对于科研来说没有太大的参考意义。

    四、标曲和样本都显色,但复孔的CV大

    这个问题就跟移液器和实验者的操作有关了。移液器的使用维护不规范,就会造成移液的误差较大。实验者自身的操作习惯、加样的一致性对复孔的CV也有很大影响。大家可以参考关于移液器使用的文章,正确使用和维护移液器。个人的操作可以在空白板上练习移液动作,或者在几十个离心管中加入相同体积的水,通过电子天平称量,检验移液的精密度。同时还需练习加快加样速度,减少从*个样本到*后一个样本加样时间过长导致的差异。

    五、本底偏高,样本值测不到

    标曲的本底即Blank孔的OD值一般要求控制在0。1以下(对于高敏ELISA可以适当放宽要求)。尤其是样本值特别低的时候,本底过高会掩盖目的信号,导致无法测到样本值。

    在加入TMB显色后,需实时观察标曲显色情况。通常在S5孔有肉眼可见的微弱蓝色,即可终止反应。

    六、样本经不同梯度稀释,计算得到的样本值差异较大

    有时候我们不清楚样本中目的蛋白的浓度如何,应该如何稀释,那么我们就会做下预实验,确定稀释倍数。然而有时候同一样本做了几个不同梯度稀释后,计算得到的样本值之间差异较大,应该选择哪一个稀释倍数呢?

    这里涉及到了基质效应。通常血清样本加样量较高时,血清中的各种蛋白会抑制抗原抗体的接触,基质效应较明显。而经过稀释后,干扰因素也随之稀释,影响就会较小。当某两个梯度稀释后,计算得到的样本值接近时,我们就可以认为在该稀释梯度时,样本中的干扰因素影响较小,计算得到的值也是接近真实的。然而这样的稀释是针对目的蛋白浓度较高的样本而言。对于浓度很低的样本,经过多倍稀释后,就更加测不到了,此时可按照厂家说明书推荐的加样方式操作。

    七、同一样本使用不同厂家的ELISA试剂盒检测,计算得到的样本值差异较大

    这里涉及到另一个评估试剂盒性能的参数——校准。不同厂家采用的标准品可能有所不同,对其定量的方法和标准也不同,这就是企业标准。因此哪怕是同一个标准品,在不同厂家各自的实验条件下测定,结果可能也会差异很大。

    因此,我们并不建议将不同厂家的结果进行对比,除非他们都是用国际标准品进行了校准。然而,并非所有蛋白都有国际标准品,因此使用不同厂家的产品计算的样本值差异较大的现象也在所难免。

但都用同一厂家的试剂盒检测样本,那么结果还是可以进行统计学分析的。

    八、不同试剂盒中的组分能否通用

    除非是公用的试剂如洗液、检测缓冲液,其它组分不建议用其它试剂盒的组分,甚至是同一指标不同批次的试剂盒里的组分。这些组分(包括标准品、标准品稀释液、检测抗体、酶等)都是经过优化的,如果贸然使用其它试剂盒的组分,有可能对结果产生影响。

    上海沪鼎拥有一批技术精湛、经验丰富的技术工程师,经过多年积累,试剂盒现已涵盖种属甚多,上千余种指标,有快速、简单、准确的特点,迎合了广大高校和科研人员的需求,极大的提高了科研人员的工作效率,成熟稳定的质量,赢得了众多科研机构的认可,完善的库存及供应体系以及高效稳定的技术指导,保证产品均能现货供应。期待您的来电。

原创作者:上海沪鼎生物科技有限公司

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